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脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的經(jīng)驗(yàn)分享

更新時(shí)間:2018-04-03  |  點(diǎn)擊率:1934
   脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的經(jīng)驗(yàn)分享:

  1、轉(zhuǎn)染前1天將0.5~2×105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板,并加入500ul不含抗生素的*培養(yǎng)基,以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90~95%。

  2、準(zhǔn)備復(fù)合物

  (1) 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。

  (2) 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中,輕輕渾勻,室溫孵育5分。注意:必須在25分內(nèi)進(jìn)行。

  (3) 5分后將它們混合,并輕輕渾勻,室溫孵育20分。

  3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基,用PBS或無血清培養(yǎng)基()清洗細(xì)胞2次。

  4、將復(fù)合物(總體積100ul)加入培養(yǎng)孔,前后搖動(dòng)培養(yǎng)板使其分布均勻。

  5、將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育4~6h后,可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物(也可不用)。

  6、24~48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況。

  7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1:10(或更高比例)傳代,1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。

  8、優(yōu)化:要保證細(xì)胞匯合率達(dá)90~95%(比較高);DNA/ Lipofectamine2000比率1:0.5~1:5,一般細(xì)胞1:2~3.

  脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的主要優(yōu)點(diǎn)是可用將DNA轉(zhuǎn)染至懸浮或者鐵壁細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高、對(duì)基因片段大小的限制較小等,但是

  陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000對(duì)細(xì)胞的毒性相對(duì)較高,為了防止其毒性,要摸索好如下實(shí)驗(yàn)條件:脂質(zhì)體2000與質(zhì)粒的比例、細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間等。

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