脂質(zhì)體2000的轉(zhuǎn)染操作步驟

　　1、操作步驟[方法一]：

　　(1)脂質(zhì)體2000的轉(zhuǎn)染準備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

　　(2)細胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液，37℃CO2培養(yǎng)至40%~60%匯合時(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞)。

　　(3) 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量)。

　　(4)轉(zhuǎn)染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

　　(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

　　注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

　　2、快速脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：

　　(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時，使其達到50~60%板底面積。

　　(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體2000復合物方法如下：

　?、僭?mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

　?、谛D(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體2000懸液，旋轉(zhuǎn)。

　?、凼覝叵路胖?~10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體2000上。

　　(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復合物，37℃培養(yǎng)3~5小時。

　　(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14~24小時，

　　(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24~48小時。

　　(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

　　3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

　　(1)接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

　　(2)DNA/脂質(zhì)體復合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前(2)、(3)步驟。

　　(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時。

　　(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。